原位雜交
基本定義
將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。

RNA原位雜交
1、RNA原位核酸雜交又稱RNA組織化學(xué)或RNA。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種技術(shù)。
2、基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合（雜交），所形成的雜交體（Hybrids）經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA技術(shù)經(jīng)不斷改進，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為zui有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達(dá)方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。

FISH
FISH是技術(shù)大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發(fā)明，現(xiàn)已從實驗室逐步進入臨床診斷領(lǐng)域。
基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標(biāo)記探針是其中zui常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細(xì)胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平的分析。熒光標(biāo)記探針不對環(huán)境構(gòu)成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮短因單個探針分開使用導(dǎo)致的周期過程和技術(shù)障礙。

例子
　　以菌落為例：
　　對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上
　　（1） 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
　　（2） 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進行劃線接種（或打點）。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。zui后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322）的菌落。
　　（3） 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
　　（4） 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
　　（5） 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
　　（6） 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。

2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
　　（1） 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
　　（2） 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟（1）。
　　（3） 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl（pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
　　（4） 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl （pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
　　（5） 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA。
　　（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的RNA進行雜交。
3.雜交　
（1） 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,*浸濕5分鐘。
　　（2） 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
　　（3） 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
　　（4） 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度（即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃）下,預(yù)雜交1-2小時。
　　（5） 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
　　（6） 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗一次，同時應(yīng)避免膜干涸。
　　（7）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒炓髧?yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
　　（8） 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。
　　（9） 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
　　（10） 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。

的應(yīng)用
　　①細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位,可用于基因圖譜，基因表達(dá)和基因組進化的研究；
　　②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和巨細(xì)胞病毒DNA的檢測；
　　③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的檢測；
　　④基因在染色體上的定位；
　　⑤檢測染色體的變化，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等；
　　⑥分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學(xué)劑量測定等。

的意義
　　：在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 雙鍵分子的特點，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA 的存在并定位；用技術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。