ELISA試劑盒直接法與間接法的區(qū)別
ELISA試劑盒可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體.在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑
1）固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"（conjugate）;
（3）酶反應(yīng)的底物.根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不類型的檢測(cè)方法.
ELISA可分類是根據(jù)抗原抗體的結(jié)合情況來(lái)分類的。
主要有以下幾種類型:（直接法也稱一步法）
1 雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體.洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì).
2） 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng).標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì).
3） 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng).固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合.*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體.此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān).
4） 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物.通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量.在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法.如抗體的來(lái)源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物.如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物.這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測(cè).
ELISA試劑盒在一步法測(cè)定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物".類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見(jiàn)1.3.2,圖1-4）,如按常法測(cè)讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect）,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果.因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等）時(shí),應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng).
假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物.但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4個(gè)亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題.
雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合.用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng).采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。
雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心. 2 雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體.與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體.此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法.乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法.本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法.
3 間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法.其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法
操作步驟如下:
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì).
2）加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng).血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去.
3）加酶標(biāo)抗抗體.可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體.固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶.洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān).
4）加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷.間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度.雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性.特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng).抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì),例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng).另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白,也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?
ELISA試劑盒間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強(qiáng),非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封閉（blocking）固相上的空余間隙.另外,在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷.