大鼠 （Rat） Toll樣受體-4 （TLR-4） ELISA 檢測試劑盒說明書
2014-01-17
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大鼠 (Rat) Toll樣受體-4 (TLR-4) ELISA 檢測試劑盒說明書
本試劑僅供研究使用
試驗原理：
TLR-4試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TLR-4濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將TLR-4和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TLR-4的濃度呈比例關系。
試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存） | 96孔配置 | 48孔配置 | 配制 |
96/48人份酶標板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） | 即用型 |
塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | 即用型 |
標準品：8.0ng/ml | 1瓶（0.6ml） | 1瓶（0.3ml） | 按說明書進行稀稀 |
空白對照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） | 即用型 |
標準品稀釋緩沖液 | 1瓶（4.0ml） | 1瓶（2.0ml） | 即用型 |
生物素標記的抗TLR-4抗體 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
親和鏈酶素-HRP | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） | 即用型 |
洗滌緩沖液 | 1瓶（20ml） | 1瓶（10ml） | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
標本稀釋液 | 1瓶（12ml） | 1瓶（6.0ml） | 即用型 |
自備材料
- 蒸餾水。
- 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
- 振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
- 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
- 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
- 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
- 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
- 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
- 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
- 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
- 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
- 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
- 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
- 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
- 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
- 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
- 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
- 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
- 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
- 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
- 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
8.0 ng/ml | （6號標準品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
4.0 ng/ml | （5號標準品） | 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
2.0 ng/ml | （4號標準品） | 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
1.0 ng/ml | （3號標準品） | 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
0.5 ng/ml | （2號標準品） | 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
0.25 ng/ml | （1號標準品） | 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
0 ng/ml | （空白對照） | 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
- 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
- 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
- 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。
- 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
- 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
- 每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
- 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
- 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
- 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果。
- 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
| 標準品濃度（ng/ml） |
| ||||||||||
A | 8.0 | 8.0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
B | 4.0 | 4.0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
C | 2.0 | 2.0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
D | 1.0 | 1.0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
E | 0.5 | 0.5 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
F | 0.25 | 0.25 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
G | 0 | 0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
H | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
局限
6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的TLR-4標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的TLR-4含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值范圍：0-8.0ng/ml
4、敏感度： 0.01 ng/ml
