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Cell:提高RNA干擾效率的沉默目標基因的RNA分子

2012-08-03 [2430]

來自冷泉港實驗室,霍德華休斯醫學院等處的研究人員研發了一種新型技術,能幫助研究人員一次篩選上千候選發夾RNA分子,從中找到能沉默目標基因的RNA分子,這對于提高RNA干擾效率具有積極的意義。相關研究成果公布在Cell出版社旗下刊物《Molecular Cell》上。

領導這一研究的是美國冷泉港實驗室Gregory J. Hannon教授,以及冷泉港實驗室癌癥研究中心,沃森生物科學學院Scott W. Lowe教授。其中Hannon教授是小RNA研究領域的,曾主編了冷泉港實驗室技術手冊:《MicroRNA研究方法》等,這篇文章的idea就是Hannon教授提出來的。

RNA干擾是目前生命科學領域中的前沿技術,從發現至今,科學家們不僅將基因功能研究的希望寄托在這種能阻斷基因表達的技術上,而且還都將治愈疑難疾病的希望也付之于其上,但是隨著研究的深入,科學家們也發現要在實際操作中進行基因沉默也不是一件容易的事。

其中一個主要的問題就是找到能開啟RNA干擾的合適分子,這種具有開關功能的分子——做過RNAi實驗的的研究人員都知道——就是發夾RNA分子,這種分子可以與目標基因的片段匹配,從而關閉基因的轉錄,蛋白的表達。

對于每一個基因而言,都有500到5000個不同的小RNAs能開啟RNA干擾(多少取決于編碼蛋白的RNA的長短),這些miRNAs中的大部分都只是弱啟動RNA分子,并不能*沉默基因活性,或者靶向另一個不同的基因,造成所謂的“脫靶”,這些都會影響相關的實驗,甚至給臨床實驗帶來毒性反應,因此選擇正確的啟動分子十分重要。

要想在眾多小RNAs中尋找合適的分子,無疑是海底撈針,挑戰不小,如果您也遇到了這樣的問題,那么也許這篇的文章能幫到您——新方法能一次性分析上千短發夾RNA分子,識別處zui有潛力的RNAi開啟分子。

首先研究人員著手在2萬個shRNAs中篩選,包括一些難以干擾的癌癥基因在內的9個目標基因的啟動發夾RNA分子,他們在一種逆轉錄病毒中插入這些候選RNAs分子,這種病毒也攜帶有目標基因(或者說是傳感器),以及熒光蛋白基因。這樣能確保當細胞被病毒入侵之后,目標基因和熒光蛋白基因,與shRNA能同時復制。

在篩選過程中,如果是無效的shRNAs,就不能阻止靶標基因RNA,以及熒光標記的表達,這樣研究人員就能檢測到熒光信號,同理如果是有效的shRNAs,那么研究人員就不能檢測到熒光信號,這樣就能篩選出有效的shRNAs了。

然后研究人員就可以提取這些包含有效shRNAs的細胞的遺傳物質,從中分析獲得shRNAs的序列。在這篇文章中,研究人員找到了9個基因各自的有效shRNAs,大約是原始shRNAs總體數量的2.5%。這項研究也意味著,研究人員可以不再需要依賴于運算法則來預測shRNAs了,畢竟運算法則推斷存在很多不確定因素,常常導致實驗的不性。

目前我們對于小RNA的產生機制了解得并不多,而這一方法也許能幫助我們大規模分析這一過程。

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